perjantai 18. huhtikuuta 2014

Pitkää perjantaita!

Minulla on vaikka minkälaista kerrottavaa näin pääsiäisen alla. Kaikkea mukavaa (ja vähän turhauttavaakin). 

Aloitetaan vaikka siitä että minulla on ihka oma gradulainen! Olen aivan innoissani. Aloitimme hommat tiistaina eristämällä DNA:ta rantakurvin (Xenus cinereus) verinäytteistä. Tarkoituksenamme on tutkia rantakurvin geneettistä rakennetta sen koko levinneisyysalueen mittakaavassa Perämeren rannalta Itä-Siperiaan saakka. Selvitämme muun muassa, eroavatko levinneisyysalueen reunalla sijaitsevat populaatiot geneettisesti ydinalueella elelevistä populaatioista. Kun levinneisyysalue on laaja, niin kuin rantakurvilla, populaatioiden välillä saattaa olla demografista ja geneettistä vaihtelua, joka kenties vaikuttaa lajin suojeluun. Kerron työstä tarkemmin tässä vuoden mittaan työn edetessä.


















Kuva 1. Rantakurvin poikanen hyppysissäni. Copyright Aija Lehikoinen (luulisin).


Toinen hyvä uutinen on se, että suosirrin mikrosatelliittiaineisto alkaa olla valmis. Tässä kävi vähän hassusti, ja yritän suhtautua asiaan huumorilla (tähän mennessä sujuu ihan hyvin). Nimittäin kävi ilmi, että ABI-niminen laite, josta kaikki mikrosatelliittitulokseni tulevat, oli viallinen! Asia on nyt korjattu, mutta olen tehnyt liioittelematta vähintään kuukausien ylimääräisen työn aineiston kanssa tapellessa. Koska tulokset ovat olleet niin vaikeasti tulkittavia, on se myös vaikuttanut työmotivaatioon ja hidastanut väikkärini etenemistä paljon. Vaikka olen tehnyt tänä vuonna hurjasti töitä, tuntuu että vasta nyt homma alkaa oikeasti etenemään.

Ensinnäkin, luullessani että PCR ei ole toiminut (koska ABI:n tulokset ovat olleet niin huonoja eikä alleeleista ole saanut tolkkua), olen tehnyt samoilta yksilöiltä jopa neljä eri PCR:ää yhtä mikrosatelliittilokusta monistaessani, tuhlaten näin DNA:ta turhaan. Haaskuseen on mennyt myös melkoisen tyyristä, ABI-ajoissa tarvittavaa alleelikokojen määrittämiseen vaadittavaa kokostandardia (yksi pieni 0,2 ml purtilo ainetta maksaa satoja euroja).

Toiseksi, olen monistanut lähes jokaisen viidestätoista mikrosatelliittilokuksestamme erikseen omissa PCR:issään, enkä niin sanotussa Multiplex-PCR:ssä, jossa yhdessä PCR-ajossa voi monistaa vaikkapa kolmea eri lokusta samanaikaisesti (koska ABI-tulokset ovat olleet niin huonoja että olen luullut, etteivät multiplexit toimi). Olen tehnyt kymmeniä ylimääräisiä PCR:iä.

Kolmanneksi, olen taistellut alleelien tulkinnan kanssa (ohjelmalla nimeltä GeneMapper) niin paljon etten muista milloinkaan tehneeni näin kovasti töitä. Alla esimerkkinä lokuksen nimeltä Cme6 uudelleen, toimivalla ABI:lla ajetut alleelit, sekä sen alla vanhat, vialliset ABI-tulokset (kuvat 2 ja 3). Ero on hämmästyttävä.



















Kuva 2. Uusi, toimiva ABI-ajo. Molemmista yksilöistä erottuu selvästi kaksi alleelia, ylemmässä yksilön CA1020 alleelit 198 ja 200, alemmassa yksilön CA1021 alleelit 190 ja 192. CA on lyhenne Calidris alpinasta, eli suosirristä.



















 

Kuva 3. Vanhan, viallisen ABI-ajon mukaan samat yksilöt, CA1020 ja CA1021, näyttivät tältä. Tulkitsin molemmat aiemmin homotsygooteiksi 198/198, ja 192/192. Ja huomaattehan, kuinka vaikeaa on päättää, laittaako alleelin 198:ksi vai 200:ksi, kun se kuvassa osuu noin 199 kohdalle (samoin alemman yksilön kanssa; onko alleeli 190 vai 192, kun se osuu melkein 191 kohdalle?). Tällaisia pyörittelin päivätolkulla ja vertailin sukulaisten alleeleita ja kävin näitä aina uudestaan ja uudestaan läpi jotta sain alleelit merkittyä systemaattisesti samalla tavalla kaikkiin.


Alla toinen lokus, CAS26, jossa oli aiemmin kaikenlaisia ongelmia (kuvat 4 ja 5). Uusinta-ABI-tuloksia katsellessani minulta kesti kaikkien yksilöiden alleelien selvittämiseen tämän lokuksen osalta yksi ainoa päivä, kun taas aiempien, huonojen tulosten takia en ollut saanut edes käytyä kaikkia yksilöitä läpi viimeisen puolen vuoden aikana!





















Kuva 4. Uuden, toimivan ABI-ajon tulos, jossa näkyy erittäin selkeästi kaksi alleelia (242 ja 246).




















Kuva 5. Samainen CAS26-lokus näytti aiemmin tältä (kuvissa eri yksilöt). En ollut varma ovatko tämän lokuksen alleelit parillisia vai parittomia (246 vai 247?), koska pylväät ovat niin leveitä että tulkinta on vaikeaa. Ja mikä on oikean 246-alleelin edessä oleva pylväs? Onko se toinen alleeli vai pelkästään ns. etupiikki? Kävi ilmi, että se ei ole alleeli, vaan jotain ylimääräistä. Molemmat kuvassa olevat yksilöt ovat homotsygootteja alleelin 246 suhteen.


Neljänneksi, koska ABI-laite oli viallinen, vaikutti se myös alleelien koon määrittämisessä käytettävän kokostandardin tulkitsemiseen. Alla esimerkit viallisesta ja toimivasta kokostandardista (kuvat 6 ja 7).




















Kuva 6. Viallinen kokostandardi. Piikit ovat aivan liian leveitä, minkä takia alleelien koon määrittäminen epämääräistyy huomattavasti.





















Kuva 7. Toimiva kokostandardi. Piikit ovat selkeitä, ja alleelien koon määrittäminen sujuu mainiosti.


Jos olisin tiennyt että vika on laitteessa eikä näytteissä tai PCR-olosuhteissa, olisin saanut aineiston valmiiksi aikoja sitten. Mistäpä sen olisi voinut tietää? Onneksi tämä kävi kuitenkin ilmi. Ja onni onnettomuudessa - kaikki ABI-näytelevyt olivat tallessa, joten ne täytyi vain ajaa laitteessa uudestaan, enkä siis joutunut pipetoimaan mitään ylimääräistä.

Kolmas mukava uutinen on, että uudet suosirrirenkaat kolahtivat postiluukusta eilen, ja että pääsiäisen jälkeen pääsen maastohommiin. Sirrit ovat siis saapuneet! Tai saapumassa. Etelä-Suomessa niitä on jo nähty reilu viikko takaperin. Kiire tulee olemaan.

Ja vielä neljäskin kiva esiuutinen: minulla on väitöskirjan valmistumisen jälkeisiä suunnitelmia. Enpäs kerrokaan niistä vielä kauheasti, hehe, katsotaan nyt miten tässä suunnitelmat etenevät, mutta sen verran voin paljastaa että ulkomaille olen lähdössä.

Oikein rauhaisaa pääsiäistä kaikille! Aasinsiltana pääsiäisestä ja suklaamunista kanoihin.

Tavataan taas toukokuussa.

Nelli

3 kommenttia:

  1. Onpa kyllä turhauttavaa! Sitä aina ensin ajattelee, että vika on itsessä, mutta kyllä se voi olla myös laitteistossa. Hyvä, että ongelma selvisi ennen maastohomien alkua!

    VastaaPoista
  2. On kyllä! Ei mulla käynyt mielen vieressäkään että kyse ois laitteistoviasta. Huoh. Onneksi kaikki nyt toimii. Labrahommia nimittäin riittää vielä seuraavaa projektia varten, joten tieto siitä, että kaikki sujuu varmasti nyt paremmin, motivoi kummasti. :)

    VastaaPoista