Labroi

Perjantaita!

Viivästys kestikin sitten kokonaisen viikon, suonette anteeksi sen!

Tällä viikolla päivät ovat menneet hujauksessa (miten ihmeessä nyt on jo perjantai?!!) molekyyliekologian labraharkkoja opettaessa ja omia labroja tehdessä. Opettaminen on ollut kivaa ja helppoa, kun kaiken opetettavan tuntee läpikotaisin ja tietää mistä puhuu. Eilen teimme yhdessä sekvensointi-PCR:n kalapuikoista eristetylle DNA:lle; tarkoituksena on katsoa (kuten viime vuonnakin kyseisellä kurssilla), onko kala sitä mitä paketissa lukee. Alkuviikosta määritimme geneettisesti talitiaisten sukupuolia, ja ensi viikolla monistamme mikrosatelliitteja. Mukavaa. :)

Omat labratyöni keskittyvät tällä hetkellä suosirrin noin 20 mikrosatelliittilokuksen monistamiseen ja näytteiden sukupuolenmäärittämiseen. Lintujen sukupuolenmääritys saattaa olla vaikeaa luonnossa, koska usein höyhenpuvut ovat samannäköiset ja koko ei välttämättä eroa sukupuolten välillä kovin paljoa. Sukupuolet voidaan kuitenkin määrittää geneettisesti; sitä varten on kehitelty alukkeet, jotka monistavat tiettyä lokusta lintujen sukupuolikromosomeissa, jotka on nimetty X:ää ja Y:tä vastaavasti W:ksi ja Z:ksi. Siinä missä esimerkiksi ihmisillä miehillä on yksi Y- ja yksi X-kromosomi ja naisilla kaksi X:ää, linnuilla naarailla on yksi kappale kumpaakin (Z ja W), ja koirailla kaksi Zetaa. Naaraat ovat siis heterogameettisia ja koiraat homogameettisia. DNA-pätkä, jota alukkeet monistavat, on eri mittainen eri sukupuolikromosomeissa. Täten, koska koirailla on kaksi samanlaista kromosomia, niillä monistuu vain yhden mittaista pätkää (sama pätkä kummastakin kromosomista). Naarailla puolestaan monistuu kahta eri mittaista DNA-pätkää (yksi molemmista kromosomista). Tämä voidaan sitten havainnollistaa ajamalla PCR-tuote agaroosigeelillä - naaraiksi voidaan määrittää ne näytteet, joiden kohdalla geelillä näkyy kaksi erillistä rantua, ja koiraiksi ne, joilla rantuja on vain yksi.












Tältä näyttää onnistunut sukupuolenmääritys (naarailla kaksi, koirailla yksi rantu). Valokuvat on otettu valokuvista, eli anteeksi oudot heijastumat...


Edelliset kuvat ovat siis agaroosigeelistä, jossa näytteet ajetaan. Geeli valetaan ajoa varten tietynlaiseen muottiin, ja geeliin lisätään ainetta (yleensä etidiumbromidia), joka sitoutuu DNA:han ja saa sen hohtamaan UV-valossa. Geeliin upotetaan valuvaiheessa "kammat", jotka jättävät geeliin kuopparivin, johon DNA-näytteet sitten pipetoidaan latauspuskurin kanssa (ks. seuraavat kuvat). Geelin läpi laitetaan kulkemaan sähkövirta, ja koska DNA on negatiivisesti varautunutta, näytteet alkavat liikkua kuopistaan ajolaitteen positiivista napaa kohti. Näytteiden kulkunopeus riippuu ensisijaisesti DNA-pätkän pituudesta; lyhyemmät pätkät kulkevat nopeammin ja pidemmät hitaammin. Myös geelin "tiukkuus" vaikuttaa eli mitä jämäkämpi geeli on (mitä enemmän siinä on agaroosia), sitä hitaammin DNA siinä kulkee. Jämäkämpää geeliä käytetään esimerkiksi sukupuolenmäärityksessä, kun halutaan saada erotettua toisistaan naaraiden kaksi erimittaista pätkää. Geelille pipetoidaan näytteiden lisäksi myös tunnettua kokostandardia, johon omien näytteiden kokoa voidaan verrata.












Lähikuva geeliin tulevista kuopista, johon näytteet pipetoidaan.












Kuvassa geeli ajon jälkeen: sinisenä näkyy näytteiden sekaan pipetoitu latauspuskuri.












Ja tässä geeli UV-valossa; punaisena hohtavat DNA-rannut näkyvät hienosti.


Edellisellä geelillä näkyy erimittaisia mikrosatelliittilokuksia. Oikeassa reunassa näkyy kokostandardi, jonka avulla oikeanpuoleiset seitsemän näytettä voidaan määrittää noin 100 emäsparin pituisiksi, ja vasemmalla olevat rannut (näkyvissä kolme ja puoli rantua) noin parisataa emäsparia pidemmiksi. Standardin rantujen koot siis tiedetään; ne ovat alhaalta ylöspäin järjestyksessä 100, 200, 300 ja 400 emäsparia. Tätä suuremmat rannut eivät ole erotettavissa tässä kuvassa toisistaan (jotta ne saisi kunnolla näkyviin ja erkanemaan, pitäisi geeliä ajaa vielä paljon pidemmälle).

Tällaisia juttuja minä siis laboratoriossa puuhastelen, ja tykkään kovasti. Onhan se hienoa kun ihan oikeaa DNA:ta, pienenpientä molekyyliä, voi näin päästä (muutamien välivaiheiden kautta) paljailla silmillä tarkastelemaan!

Tässä vielä kohtalokas näyteputki, nimesin linnun Damieniksi.











Hyvää viikonloppua, me lähdetään Annan kanssa hiihtelemään ja rentoutumaan pariksi päiväksi.