Lisää mikrosatelliitteja

Heippa kaikille!

Tuntuu etten ole kuukaudessa edennyt mihinkään. Siispä jatkan aivan samasta aiheesta kuin viimeksikin - suosirrin mikrosatelliittiaineiston käsittelystä. Takana on kiireisin kuukausi pitkään aikaan, ja töitä on tullut tehtyä reippaalla tahdilla, mutta hommaa on niin paljon että tässä menee varmasti vielä aikaa.

Löysin aineistosta kaikenlaisia virheitä, ja olen nyt käynyt läpi kaikkien noin 600 yksilön yhdentoista mikrosatelliittilokuksen alleeleita, lokus kerrallaan. Kun saan tämän valmiiksi, voin hyvillä mielin todeta että pohjatyö on nyt tehty kunnolla ja aineistoon voi luottaa (vaikka toki sinne varmasti joitain virheitä aina jää). Alussa tuntui että edessä on aivan loppumaton urakka, mutta pakkohan tämä on tehdä, muuten tulee epäkelpoja tuloksia. Viimeiset pari viikkoa tätä on tehnyt ihan hyvillä mielin, eipähän tekeminen lopu!

Huomasin monissa tapauksissa virheen mikrosatelliittiajoissa mukana olevassa kokostandardissa, aineessa, jonka perusteella tietokoneohjelma tunnistaa ja ilmoittaa analysoiduille yksilöille niiden alleelien pituudet. Jos kokostandardi on väärin luettu, alleelikoot menevät pieleen. Ainetta siis kirjaimellisesti pipetoidaan jokaisen näytteen kanssa samaan kuoppalevyn kaivoon. Kukin näyte ajetaan elektroforeesilaitteen läpi, jossa DNA kulkeutuu tietyllä nopeudella (pidemmät DNA-pätkät hitaammin, lyhyemmän pätkät nopeammin), ja tietokone hoitaa alleelien tunnistamisen ja niiden kokojen määrittämisen juuri kokostandardin avulla.

Alla on esimerkki tapauksesta, jossa GeneMapper on laittanut kokostandardin 139-emästä pitkän piikin väärään paikkaan (vasemmalla). Tummalla on merkitty sen oikea paikka. Joudun manuaalisesti klikkaamaan kokostandardipiikkiä, deletoimaan väärän koon, klikkaamaan oikeaa piikkiä, ja lisäämään siihen äsken deletoidun numeron (oikealla).












Yksinkertaisimmissa tapauksissa homma on sillä selvä, ja alleelit ovat korjauksen jälkeen oikeilla paikoillaan, oikean pituisina. Joissain tapauksissa kaikki piikit ovat kuitenkin väärin merkittyjä. Siinä on hiirikäsi kovilla kun klikkailee ja muuttelee kokostandardien kokoja pitkin päivää.

Alla on sitten esimerkki siitä, miten alleelikoko muuttuu kun kokostandardi korjataan. Väritin pinkillä alleelipiikeistä sen osan, jonka perusteella alleelikoko on määritetty. Vasemmalla olevassa kuvassa kokostandardi on väärä, joten suosirriyksilö numero 269 näyttäisi olevan Calp2-mikrosatelliittilokuksen suhteen heterotsygootti alleelein 128/140 (vaikka oikeastaan alleelit näyttäisivät pikemminkin osuvan kohdille 127 ja 139 - tämä oli siis hieman epäselvä tapaus, jonka perusteella tajusin lähteä etsimään virhettä kokostandardista). Oikealla näkyy sama yksilö kokstandardin korjauksen jälkeen. Nyt alleelit ovatkin selvästi 126/138!













Pienikin virhe kokostandardissa voi siis muuttaa alleelikokojen tulkitsemista. Koska virheitä näytti löytyvän kymmenistä yksilöistä, päädyin siihen että kaikki yksilöt täytyy käydä läpi ennen kuin aineiston perusteella voi tehdä huolellisia analyysejä.

Tällä hommalla jatketaan, mutta toivottavasti ei aivan koko loppukevättä. Päivän tietokoneella istumisen jälkeen olen rentoutunut lähinnä siementen (nyt jo taimien) ja mullan parissa. Ja iltaisin taustalla näkyvän teoksen merkeissä (uni tulee mukavasti tätä lukiessa:). Kesä ja chilit, täältä tullaan!











Nelli

Vanhemmuudesta ja syrjähypyistä

Ei, en ole hankkinut viime aikoina lapsia, enkä käynyt vieraissa. Mutta suosirritpä käyvät, ja se näkyy niiden jälkeläisissä - geneettisesti.

(Ja anteeksi kun en eilen kirjoittanut. Koko päivä oli yhtä juoksua. Sain nimittäin valmiiksi viikon aikana kirjoittamani APURAHAHAKEMUKSEN Suomen Kulttuurirahaston Pohjois-Pohjanmaan maakuntarahastolle! Toukokuussa selviää, saanko ensi vuodeksi rahoituksen.)

Sain isyysanalyysit tehtyä ongelmitta pari viikkoa sitten. Nyt tarkastan tuloksia, eli käytännössä käyn läpi kaikki ne mikrosatelliittiajot, joista löytyi eroavaisuuksia poikasten ja vanhempien välillä. Alla näkyy esimerkkinä kahden yksilön mikrosatelliittiajot lokuksen Ruff6 osalta (Ruff on englanniksi suokukko, jolle mikrosatelliittilokus alunperin on suunniteltu). Yksilöt eivät ole sukua keskenään.

Y-akselilla näkyy alleelipiikin "voimakkuus", eli kuinka hyvin se on monistunut PCR-laitteessa - mitä korkeampi piikki, sitä enemmän siitä on kopioita. (Joskus alleelipiikit ovat hyvin selkeitä [näkyvillä on vain yksi ainoa piikki], mutta joskus niitä on hyvin vaikea lukea. Tässä tapauksessa lukeminen on vielä suhteellisen helppoa, vaikka yksi alleeli onkin monihuipukas.) X-akselilla on alleelin koko emäspareina (esimerkiksi vasemmanpuoleinen yksilö on heterotsygootti alleelein, jotka ovat 130 ja 142 emäsparia pitkiä). Koon päättäminen voi olla vaikeaa kun alleeleissa on niin monta erikokoista piikkiä. Silloin täytyy vain pysyä johdonmukaisena ja merkitä alleelin koko aina saman piikin perusteella, kuten alla olevassa tapauksessa leveimmän kohdan mukaan.













Tästä löysin virheen: vasemmalla olevassa kuvassa oleva yksilö on siis heterotsygootti. Oikeanpuolesessa kuvassa yksilö on myös merkitty heterotsygoottiseksi, alleelein 130 ja 134. Kuitenkin tarkasteltaessa alleelipiikkien muotoa, huomasin että oikeanpuoleinen yksilö on oikeasti homotsygootti 134-alleelin suhteen. Oikeassa kuvassa 130-alleeliksi merkitty piikki näkyy hyvin vasemmanpuoleisen yksilön molemmissa alleeleissa. Piikki on siis osa alleelia, ei omansa. Virheen löysin, kun isyysanalyysi ehdotti oikeanpuoleista poikasta EPF-poikaseksi (extra-pair fertilization). Sen molemmat vanhemmat olivat homotsygootteja alleelin 134 suhteen, joten poikanen ei olisi voinut saada alleelia 130 mistään muualta kuin parin ulkopuoliselta yksilöltä. Tapaus ratkesi, ja poikanen oli kuin olikin vanhempiensa summa.

Monissa tapauksissa alleelit kuitenkin näyttävät olevan oikein luettuja, ja vaikka vain yhdessä lokuksessa olisi ero poikasen ja isän välillä, ne tulkitaan EPF-poikasiksi. Vastaan on tullut muutama tapaus, joissa poikanen eroaa lähes kaikissa lokuksissa isästään. Olisivatpa kaikki näin selkeitä! Vielä en osaa sanoa kuinka paljon EPF-poikasia suosirreillä keskimäärin on, sillä aineiston tarkastaminen on vielä kesken.

Tässäpä pieni käytännön katsaus työhöni. Paperihommia, paljolti.

Hyvää viikonloppua,

Nelli

Reipas startti uuteen vuoteen

Hyvää alkanutta vuotta kaikille! Palasin töihin maanantaina, unirytmi sekaisin loman jäljiltä, ihmetellen mihin ihmeeseen minä jäinkään. Tiistaihin mennessä olin taas kartalla, ja nyt olen saanut koottua koko suosirriaineiston (vihdoinkin) oikeaan muotoon exceliin ja pääsen tänään aloittamaan analyysit! Ensi viikolla voin sitten kirjoittaa menetelmät ja tulokset, sitten johdannon ja pohdinnankin ja juttu voidaan julkaista jo tänä keväänä. Tai sitten ei. Mutta kuulostaisi kivalta, eikö? Ensin kuitenkin peukut pystyyn että analyysit toimivat ja tuloksia tulee.





Tutkin nyt sitä, onko suosirreillä paljon parin ulkopuolisia jälkeläisiä (engl. extra-pair fertilization, EPF tai extra-pair paternity, EPP). Käytännössä tämä tapahtuu listaamalla vuosittain kaikkien poikasten, niiden emojen ja kaikkien paikalla olleiden koiraiden genotyypit (tässä tapauksessa mikrosatelliitit) ja tarkastelemalla vastaavatko poikasten genotyypit vanhempien genotyyppejä. Jos poikaset ovat pesän "sosiaalisen parin" jälkeläisiä (eli sen parin, joka pesällä hääräilee ja hautoo), poikasten genotyypit vastaavat vanhempien genotyyppejä (puolet poikasen mikrosatelliittialleeleista tulee äidiltä, puolet isältä).

Jollain poikasella voi kuitenkin olla ns. mismatcheja mikrosatelliiteissaan, eli puolet sen mikrosatelliittialleeleista vastaa sen äidin mikrosatelliitteja, mutta toinen puoli ei sovikaan pesän koiraaseen, sosiaaliseen isään, vaan vastaa jonkin toisen koiraan mikrosatelliitteja. Tällöin naaras on käynyt vieraissa, paritellut pesinnän aikana jonkin toisen koiraan kanssa muodostaen tämän kanssa "geneettisen parin". Osa jälkeläisistä voi siis olla jonkun toisen koiraan siittämiä.

Analyysien ja kirjoitustyön ohessa pitäisi saada tentittyä yksi kirja liittyen luonnonsuojelubiologiaan. Kevään opetushommista en vielä tiedä - saattaa olla että pääsen taas molekyylilekologian kurssille avustamaan. Minua yritettiin nakittaa myös tilastomatikan harkkoihin opettajaksi, mutta kieltäydyin kohteliaasti. Saavat laittaa asialle jonkun jolla on parempi matikkapää.

Kaiken ajattelutyön ohella on mukava välillä rentoutua aiheeseen liittyvän sarjakuvan parissa, joka tarjoaa osuvia sutkautuksia jatko-opiskelun arjesta. Jos sarjakuva käsittelee jatko-opiskelua, eikö sen lukeminen silloin kuulu työhöni? Ai ei?





Nyt niiden analyysien pariin että ehtii tämän päivän aikana saada jotain valmiiksi asti!

Nelli